Eucariotas superiores
Todas las células de un organismo tienen todos los genes, por lo que ha de haber una regulación en la expresión de estos genes. Dentro de esta regulación distinguimos entre regiones reguladoras y factores de transcripción. Regiones reguladoras Promotores Elementos o secuencias de control, situados en 5’, normalmente “Enhancers”, que puede estar en 5’ o 3’, o incluso, lejos del gen Factores de transcripción Factores generales o basales Factores constitutivos Factores específicos Regiones reguladoras Para que haya una correcta expresión del gen, debe haber regiones que controlen esta expresión, que son las secuencias de control o reguladoras. Suelen tener unos 18pb, a la vez que suelen ser también palindrómicas. Suelen actuar también en forma dimérica, en cuyo caso están separadas unos 10 pb, lo que sería equivalente a 1 giro en la hélice de DNA, para que las proteínas que se unan a estas secuencias se mantengan unidas a un mismo lado de la hélice. Puede haber secuencias también de unos 4pb, pero en ese caso se suelen repetir algunas veces. Para estudiar las regiones reguladoras se utilizan técnicas de interacción entre el DNA y las proteínas. Retraso en gel Footprinting con DNAasas.
Retraso en gel Consiste en el hecho de que si se une una proteína al DNA, este avanzará más despacio en el gel. Se hace correr al DNA en un gel, pero permitiendo que vaya libremente al principio. En otro caso se le expone a alguna proteína, de manera que si la proteína se une al DNA, la movilidad bajará. En las regiones que se haya unido esta proteína tendremos posiblemente regiones de control. Footprinting Se somete al DNA a un baño proteico, para después someter ese DNA a la acción de las DNAasas. Si queda algún fragmento entero, será debido a que se le había unido alguna proteína, ya que en ese caso la proteína protegerá al DNA. Se pueden marcar una serie de fragmentos de DNA, y se permite su unión a la proteína, para después someter los fragmentos a DNAasas, de manera que la diferencia entre un fragmento y otro sea una base. Al hacer una electroforesis veremos que no habrá señal en la zona donde está la proteína. A partir de este punto tenemos las secuencias donde se unen las proteínas, pero no su función, para lo que se pueden emplear análisis de deleciones. Análisis de deleciones Partimos de la expresión conocida de una proteína, con todas sus regiones reguladoras. A partir de esa expresión deducimos si se trata de un activador o de un represor en función de si al eliminar ese fragmento la expresión aumenta o disminuye. Genes reporteros La expresión de este gen permite estudiar toda la región reguladora sin el problema de que la expresión afecte a la célula. Las características principales de un gen reportero son que el producto que sintetiza sea inocuo para la célula, y que sea de fenotipo fácilmente detectable. Algunos de los genes que se usan son CAT, cloranfenicol acetil transferasa; lacZ, β galactosidasa; y lux, luciferina, que otorga bioluminiscencia. CAT CAT es el enzima que cataliza la transferencia del grupo acetil del Ac. CoA al cloranfenicol. Puede formar dos tipos de cloranfenicol, en función de la cantidad de grupos acetil que tenga. Estos distintos tipos de cloranfenicol se podrán distinguir por cromatografía en capa fina, y si se emplea C14 se podrán ver por autorradiografía. Cuanto más CAT haya más acetilación del cloranfenicol se producirá, de manera que podremos diferenciar los dos tipos de cloranfenicol, ya que migrarán de diferente manera. El vector CAT que se emplea ha de contener la región que estamos estudiando, al lado del gen cat, de manera que se exprese este. Si estamos haciendo una análisis por deleciones de la región reguladora, tendremos diferentes tipos de vectores CAT. Actualmente se emplea la bioluminiscencia, mediante la luciferaza, de manera que depende de la cantidad de luz. En las fotocopias podemos observar diferentes ejemplos de cómo trabajar con las deleciones. En un primer caso observamos como se va eliminando la parte anterior al inicio de un gen, con lo que se va reduciendo la síntesis. En el segundo caso se van eliminado fragmentos, con lo que el efecto sobre la síntesis dependerá de si se trata de un enhancer o de un silencer. Si se trata de un activador, la expresión bajará, pero si se trata de un silenciador, la síntesis aumentará.
