Autosplicing
Este tipo de splicing se da en alguno orgánulos. Se formarán estructuras características, que permitirán que se produzca el splicing. En el caso de los intrones de tipo II, el proceso de splicing es similar al descrito anteriormente, ya que se produce una reacción de un grupo OH con una A, mientras que en los de tipo I, el grupo OH reacciona con una G externa del RNA. Estos tipos de RNA tienen la capacidad de realizar splicing in vitro, por si mismos, aunque in vivo puede intervenir alguna proteína en el proceso. Se han de formar unas estructuras específicas, mediante las cuales se darán los cortes en el RNA, ya que la estructuras formarán centros catalíticos. En los intrones de tipo II se formarán estructuras similares a las descritas anteriormente, formándose incluso el lariat. Los centros catalíticos que se formarán serán también similares a los anteriores. El splicing ha ido evolucionando desde una fase inicial autocatalítica, con capacidad de splicing promovida por el propio RNA hasta el caso de los mRNA, donde el RNA ha perdido la capacidad de formar las estructuras que forman los centros catalíticos, sino que requieren la formación del spliceosoma. Estos intrones con capacidad autocatalítica, de tipo I o II son muy escasos, están solo en los orgánulos.
Eliminación de los intrones del mRNA
La mayoría de los mRNA tienen intrones, normalmente varios y de diferentes tamaño. Hemos de preguntarnos si, cuando existen varios intrones en un gen, se eliminarán siempre en el mismo orden. Esto se ha estudiado con Northerns. Se ha observado que hay un orden preferente de eliminación de intrones, tal y como se ve en la tabla. No se eliminan en orden secuencial 5’ – 3’, sino que sigue otro orden. Parece ser que el hecho de eliminar un intrón favorece la eliminación de otros. Para localizar los intrones emplearemos la comparación del DNA genómico con el cDNA. Frecuencia de perdida de los intrones individualesNúmero de intrones eliminadosA B C D E F G 1 5 0 0 0 30 60 5 2 20 20 0 2 60 60 25 3 5 5 5 30 100 95 60 4 10 25 35 95 90 90 55 5 40 75 65 85 100 75 60 6 55 100 80 90 100 100 80 No existen grandes regiones de homología en las zonas de conexión intrón – exón, sino que se trata de pequeñas secuencias consenso. Siempre existe la misma secuencia al empezar y acabar el intrón, GT – intrón – AG. Obviamente hay excepciones, ya que hay genes que pueden tener secuencias que pueden ser AT – intrón – AG. En eucariotas superiores también habrá regiones ricas en pirimidinas antes de AG en el extremo 3’ del intrón. Un mRNA puede pasar correctamente por el proceso de splicing en cualquier célula, una excepción serían lo que se conoce por splicing alternativo, como ya veremos más adelante. Existen enferemedades que pueden estar ocasionadas por mutaciones en el proceso de splicing. Además, existen lugares de splicing crípticos, que no utilizarán en condiciones habituales, pero que sí se emplearán en caso de que le ocurra algo al lugar de splicing habitual. La liberación del lugar de splicing 5’ se produce por una transesterificación provocada por el grupo hidoxilo unido al carbono 2’ de un nucleótido de Adenosina, de una secuencia conservada que es 5’-UACUAAC-3’. El resultado de esta reacción es la rotura del enlace fosfodiester que une el primer nucleótido del intrón, acompañado por la formación de una nuevo enlace fosfodiester de este primer nucleótido con la adenosina del centro del intrón, del centro de ramificación, mediante una unión 5’ – 2’. El intrón tiene ahora una estructura en forma de loop que se conoce como lariat. La rotura del lugar 3’’ de splicing y la unión de los exones es el resultado de una nueva transesterificación , provocada por el grupo OH unido a la parte upstream del exon. Este grupo ataca la unión fosfodiester en el lugar 3’ de splicing, provocando la liberación del intrón en forma de lariat, que será linearizado y degradado. Al mismo tiempo, los extremos de los exones se unirán. Las secuencias de splicing son reconocidas por las smRNPs, small ribonucleoproteins, formadas a partir de smRNAs y unas diez proteínas. En el proceso de splicing hacen falta smRNPs, como U1, U2 y U5, además de U4/U6. Junto a esto harán falta algunos factores de splicing más. Se observó que la smRNP U1 tiene en su extremo 5’ 14 nucleótidos no aparejados, que son bastante complementarios a los del lugar 5’ de splicing, de manera que por complementariedad se unirán. U2 tienen complementariedad con el punto de ramificación. U3 se une al extremo 3’ de splicing,pero no por complementariedad, sino por interacciones de proteínas. Todo esto se une sobre el precursor, formando lo que se conoce como spliceosoma. En primer lugar se une U1 al lugar 3’ de splicing, para que después se unan los factores que se conocen como U2AF, que son factores auxiliares que se unirán a la tira de pirimidinas, de manera que permitirán la unión de U2. U2 se une por complementariedad al punto de ramificación, formando el total lo que se conoce como complejo A. Se unen también las proteínas SR, ricas en serinas y argininas. El papel de estas proteínas es el de evitar que al hacer splicing se salten intrones en lo que se conoce como Intron skipping. Estas proteínas unen U1 con U2AF, lo que provoca una curvatura en el RNA. Después llega el complejo U4/U6, que se une a U2. U5 se une al exón situado downstream. Este es el momento cuando se establece contacto entre U1 y U2. El proceso de splicing se inicia al liberarse U1 y U4. U6 se unirá donde se unía U1. La proximidad de U2 y U6 dispara las reacciones de transesterificación, con lo que se liberará el intrón.
Precursores del tRNA
Algunos de los genes que codifican los tRNA tienen intrones, entre un 10 y un 20% del total de genes. Estos intrones son relativamente cortos. En levaduras hay un intrón en el extremo 3’. No existen secuencias consenso en los extremos del intrón. Cuando hay un intrón, se produce normalmente un alargamiento del brazo del anticodón. Lo primero que se hace es eliminar el intrón, mediante una ribonucleasa , con lo que queda un grupo fosfato unido a un extremo 3’ el exon upstream y un grupo OH unido al extremo 5’ del exon downstream. Estos extremos se unen por la complementariedad de bases típica y son unidos por una RNA ligasa.
