Determinación del sexo en Drosophila
Implica la interacción de una serie de genes. Cada uno de estos genes tendrá un splicing diferencial, cuyo producto influirá sobre el siguiente gen de la cascada génica, determinado así el sexo. Todo depende de la relación entre cromosomas sexuales y autosomas. El primer gen que se ve influido por este proceso es el gen sex – lethal, que posee 7 exones, pero en el 3 hay un codón de stop. En hembras se provoca un splicing alternativo que provoca que se elimine ese exón de la proteína final. Por lo tanto, en machos no hay proteína funcional, pero en hembras sí será funcional y influirá en el siguiente splicing. El siguiente gen del proceso es el transformer, donde podemos encontrar 4 exones, con un codón de stop en el segundo. Debido a la proteína Sxl, producida por el gen sex – lethal, se inhibe el splicing normal y se activa un splicing alternativo, en un lugar críptico, que eliminará el codón de stop. En hembras habrá una proteína resultante de este proceso, mientras que en machos la proteína no será funcional. El producto, Tra, influirá sobre el gen siguiente, el transformer 2, donde pasará aproximadamente como en el caso anterior. Estos 2 último productos influirá en la expresión del último gen, que es el doublesex, que posee 6 exones, con un codón stop en el cuarto. El Tra y el Tra2 son factores de splicing que provocan que el splicing en hembras se haga de manera normal, de manera que se pasará por el codón de stop del cuarto exón. En machos se eliminará el exón con el codón stop, con lo que la proteína será más larga. La proteína Dsx de las hembras elimina la expresión de los genes de los machos, mientras que las proteínas Dsx de los machos bloquean los genes de las hembras. La proteína Sxl impide que U2AF se una en el punto normal del intrón por lo que lo hace en el interior del exón, con lo que se provoca el splicing alternativo. Las proteínas Tra y Tra2 interaccionan con las proteínas SR. Sin estas proteínas se da un splicing que elimina el exón 4. En presencia de estas proteínas SR, el exón no es eliminado. El lugar donde se unen las proteínas Tra se conoce como splicing enhancer.
Splicing alternativo
No se ha de confundir el splicing alternativo con la maduración diferencial. La mayoría de los genes de clase II se transcriben dando lugar aun mRNA precursor que madurará para dar lugar a un mRNA maduro. Pero se ha visto que en ocasiones un mismo gen puede dar diferentes mRNA. Puede haber diferencias en los extremos 3’ o 5’, pero incluso puede haber diferentes tipos de splicing. Si se utilizan diferentes tipos de splicing hablaremos de splicing alternativo. Si se trata de diferentes modificaciones en los extremos 3’ o 5’, se trtará de maduración diferencial. Estos patrones de splicing se da solo en función de una expresión diferencial del gen, pero también es posible que los diferentes productos de un gen se expresen en una misma célula, al mismo tiempo, pero en diferente proporción. A nivel de splicing, puede ser posible que uno de los dos lugares de splicing sea fijo, mientras que elk otro puede ir variando. En algunos casos puede ser que al variar el splicing se modifique la secuencia de aminoácidos, provocando la aparición o no de un codón de stop, con lo que semodificaría el tamaño de la proteína. Se conocen muchos casos de genes con splicing alternativos, como el caso en SV40, con los diferentes antígenos T y t, donde dependiendo del splicing se pasará o no por un determinado codón de stop, de manera que la proteína será más o menos larga. Hay una parte que puede actuar como intrón o como exón. El RNA de t será más largo, pero será la proteína T la que tenga mçás aminoácidos, ya que en t hay un codón de stop. Este tipo de splicing tienen lugar en todas las células, variando la proporción de T y t. En células con alta proporción en t, de manera que se usaban los sitios de splicing más cercanos, se identificó un factor, el SF2, que se observó que favorecía la utilización de sitios de splicing más cercanos. La proteína del adenovirus E1A también pasa por procesos de splicing alternativo para dar lugar a tres proteínas diferentes.
Eliminación de los intrones del mRNA
La mayoría de los mRNA tienen intrones, normalmente varios y de diferentes tamaño. Hemos de preguntarnos si, cuando existen varios intrones en un gen, se eliminarán siempre en el mismo orden. Esto se ha estudiado con Northerns. Se ha observado que hay un orden preferente de eliminación de intrones, tal y como se ve en la tabla. No se eliminan en orden secuencial 5’ – 3’, sino que sigue otro orden. Parece ser que el hecho de eliminar un intrón favorece la eliminación de otros. Para localizar los intrones emplearemos la comparación del DNA genómico con el cDNA. Frecuencia de perdida de los intrones individualesNúmero de intrones eliminadosA B C D E F G 1 5 0 0 0 30 60 5 2 20 20 0 2 60 60 25 3 5 5 5 30 100 95 60 4 10 25 35 95 90 90 55 5 40 75 65 85 100 75 60 6 55 100 80 90 100 100 80 No existen grandes regiones de homología en las zonas de conexión intrón – exón, sino que se trata de pequeñas secuencias consenso. Siempre existe la misma secuencia al empezar y acabar el intrón, GT – intrón – AG. Obviamente hay excepciones, ya que hay genes que pueden tener secuencias que pueden ser AT – intrón – AG. En eucariotas superiores también habrá regiones ricas en pirimidinas antes de AG en el extremo 3’ del intrón. Un mRNA puede pasar correctamente por el proceso de splicing en cualquier célula, una excepción serían lo que se conoce por splicing alternativo, como ya veremos más adelante. Existen enferemedades que pueden estar ocasionadas por mutaciones en el proceso de splicing. Además, existen lugares de splicing crípticos, que no utilizarán en condiciones habituales, pero que sí se emplearán en caso de que le ocurra algo al lugar de splicing habitual. La liberación del lugar de splicing 5’ se produce por una transesterificación provocada por el grupo hidoxilo unido al carbono 2’ de un nucleótido de Adenosina, de una secuencia conservada que es 5’-UACUAAC-3’. El resultado de esta reacción es la rotura del enlace fosfodiester que une el primer nucleótido del intrón, acompañado por la formación de una nuevo enlace fosfodiester de este primer nucleótido con la adenosina del centro del intrón, del centro de ramificación, mediante una unión 5’ – 2’. El intrón tiene ahora una estructura en forma de loop que se conoce como lariat. La rotura del lugar 3’’ de splicing y la unión de los exones es el resultado de una nueva transesterificación , provocada por el grupo OH unido a la parte upstream del exon. Este grupo ataca la unión fosfodiester en el lugar 3’ de splicing, provocando la liberación del intrón en forma de lariat, que será linearizado y degradado. Al mismo tiempo, los extremos de los exones se unirán. Las secuencias de splicing son reconocidas por las smRNPs, small ribonucleoproteins, formadas a partir de smRNAs y unas diez proteínas. En el proceso de splicing hacen falta smRNPs, como U1, U2 y U5, además de U4/U6. Junto a esto harán falta algunos factores de splicing más. Se observó que la smRNP U1 tiene en su extremo 5’ 14 nucleótidos no aparejados, que son bastante complementarios a los del lugar 5’ de splicing, de manera que por complementariedad se unirán. U2 tienen complementariedad con el punto de ramificación. U3 se une al extremo 3’ de splicing,pero no por complementariedad, sino por interacciones de proteínas. Todo esto se une sobre el precursor, formando lo que se conoce como spliceosoma. En primer lugar se une U1 al lugar 3’ de splicing, para que después se unan los factores que se conocen como U2AF, que son factores auxiliares que se unirán a la tira de pirimidinas, de manera que permitirán la unión de U2. U2 se une por complementariedad al punto de ramificación, formando el total lo que se conoce como complejo A. Se unen también las proteínas SR, ricas en serinas y argininas. El papel de estas proteínas es el de evitar que al hacer splicing se salten intrones en lo que se conoce como Intron skipping. Estas proteínas unen U1 con U2AF, lo que provoca una curvatura en el RNA. Después llega el complejo U4/U6, que se une a U2. U5 se une al exón situado downstream. Este es el momento cuando se establece contacto entre U1 y U2. El proceso de splicing se inicia al liberarse U1 y U4. U6 se unirá donde se unía U1. La proximidad de U2 y U6 dispara las reacciones de transesterificación, con lo que se liberará el intrón.
